刘宇飞副主任医师
江苏省肿瘤医院 肿瘤内科
免疫组化是一种用于检测组织样本中特定抗原表达的实验技术，主要包括样本制备、抗体选择与标记、染色步骤以及结果分析这四个部分。
（1）固定：通过使用福尔马林等固定液对组织样本进行固定，使组织结构和抗原稳定。此过程需持续4至24小时，根据样本大小调整时间。
（2）包埋：将固定后的组织浸入石蜡，形成石蜡块，用于后续切片。
（3）切片：利用切片机将石蜡包埋的组织切成5至10微米厚的薄片，并将切片粘附在载玻片上。
（4）脱蜡：切片需要经过二甲苯或其他溶剂处理，以去除石蜡并使组织恢复到水合状态。
（1）初级抗体：选择针对目标抗原的特异性抗体，这是免疫组化的核心步骤，直接决定实验成功与否。
（2）次级抗体：如果使用间接法，还需选择能识别初级抗体的次级抗体，此类抗体通常连接有酶或荧光基团。
（3）酶/荧光标记：为了方便检测，次级抗体常结合辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等，与靶抗原结合后可显现颜色或荧光信号。
（1）抗原修复：当抗原位点因固定或包埋受损，需要通过热修复或酶修复技术暴露抗原以提高结合率。
（2）阻断：为避免非特异性结合，用正常动物血清或蛋白阻断试剂覆盖组织表面。
（3）抗体孵育：将初级抗体滴加到载玻片上的组织区域，放置37℃或室温孵育1至2小时；随后加入次级抗体重复孵育。
（4）显色：滴加底物，如DAB，酶催化产生棕色沉淀，显示阳性信号；或用荧光染料观察发光。
（5）复染：通常用苏木素染核，帮助区分组织结构。
（1）显微镜观察：利用普通显微镜观察染色结果，确定阳性部位及强度。
（2）图像记录：拍摄图片保存结果，便于进一步分析与归档。
（3）数据量化：借助专业软件分析染色面积比例和信号强度，为研究提供客观支持。
免疫组化是一项操作性较强、精确性要求高的实验技术，在临床诊断与科研中广泛应用。从样本制备到结果分析，每一步都需严格控制条件以保证实验结果的准确性和可靠性。