免疫组化怎么做

免疫组化是一种利用抗原抗体特异性结合反应，对组织切片或细胞样本中特定蛋白质进行原位定位与定性检测的技术，其核心流程包括样本固定、切片制备、抗原修复、抗体孵育、显色及复染等步骤。

免疫组化操作的核心步骤与关键参数

1、样本固定与包埋：组织离体后需在30分钟内置于中性缓冲福尔马林溶液中固定，固定时间通常为6至24小时。固定不足会导致抗原弥散，固定过度则会掩盖抗原决定簇。固定完成后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切成3至5微米厚的连续切片。

2、切片脱蜡与水化：石蜡切片需在60摄氏度恒温箱中烘烤1至2小时，随后依次经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10分钟，再经无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各3至5分钟，最后蒸馏水冲洗2至3分钟。脱蜡不彻底会造成背景着色。

3、抗原修复：这是决定染色成败的关键环节。甲醛固定会产生醛交联，遮蔽抗原决定簇。常用修复方法有两种：高温高压修复采用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或乙二胺四乙酸缓冲液（pH 9.0），在121摄氏度条件下维持2至3分钟；酶消化修复则使用胰蛋白酶或胃蛋白酶，在37摄氏度孵育10至30分钟。修复液的选择需根据目标抗原特性确定。

4、阻断内源性过氧化物酶：使用3%过氧化氢溶液室温孵育10至15分钟，以消除内源性过氧化物酶造成的假阳性着色。随后用磷酸盐缓冲液浸洗3次，每次3分钟。

5、抗体孵育：滴加适当稀释的一抗，在4摄氏度湿盒中孵育过夜，或在37摄氏度孵育1至2小时。一抗浓度需经预实验确定。磷酸盐缓冲液浸洗3次后，滴加二抗，室温孵育20至30分钟。

6、显色与复染：滴加二氨基联苯胺显色液，显微镜下控制显色时间，通常为3至10分钟，阳性信号呈棕黄色。苏木素复染细胞核1至3分钟，盐酸乙醇分化，氨水返蓝。

7、脱水封片与结果判读：切片经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片。阳性判定需结合阳性部位、阳性强度及阳性细胞比例综合评估。

中国病理行业规范《临床技术操作规范·病理学分册》对免疫组化染色的对照设置提出明确要求，每批次染色应设立阳性对照与阴性对照。据中国医学装备协会病理装备分会2021年发布的调查数据，国内约73.6%的病理科已采用全自动免疫组化染色仪进行标准化操作，手工操作比例逐年下降。

操作中需关注的要点

• 抗原修复液pH值直接影响染色结果，不同抗原对pH的敏感性存在差异。
• 一抗孵育温度与时间需根据抗体说明书及预实验结果调整，孵育温度升高时孵育时间应相应缩短。
• 显色时间需在显微镜下实时监控，避免过度显色导致背景加深。

免疫组化染色质量受固定、修复、抗体浓度及显色时间等多因素共同影响，标准化操作与对照设置是获得可靠结果的基础。

常见问题

是。常见原因包括抗原修复不充分、一抗浓度过低或失效、组织固定过度掩盖抗原决定簇，需逐一排查修复条件与抗体效价。

是。可尝试降低一抗浓度、延长过氧化氢阻断时间、增加磷酸盐缓冲液洗涤次数，或更换显色系统以减少非特异性结合。

是。免疫组化基于抗原抗体反应定位特定蛋白质，特殊染色基于化学显色反应显示糖原、黏液、胶原等成分，两者原理与应用范围不同。

是。封片后的切片在室温避光条件下通常可保存数年，但二氨基联苯胺显色信号会随时间延长而减弱，建议在染色后6个月内完成判读。

参考资料

[1] 中华医学会. 临床技术操作规范·病理学分册. 人民军医出版社.

[2] 中国医学装备协会病理装备分会. 中国病理科免疫组化自动化设备使用现状调查报告. 2021.

[3] 王恩华. 病理学. 高等教育出版社.

[4] 中华病理学杂志. 免疫组化染色标准化操作专家共识. 中华医学会病理学分会.