什么是免疫组化sp法

免疫组化SP法即链霉亲和素-过氧化物酶连接法，属于免疫组织化学染色中的一种非生物素检测系统，通过链霉亲和素与生物素化二抗结合，再借助过氧化物酶催化显色底物，从而定位组织或细胞中的特定抗原。

方法的基本构成

1、第一层试剂：特异性一抗，用于识别待检组织切片中的目标抗原。

2、第二层试剂：生物素化二抗，能与一抗的种属特异性片段结合。

3、第三层试剂：链霉亲和素-过氧化物酶复合物，链霉亲和素具有四个生物素结合位点，可高效连接二抗上的生物素。

4、显色系统：常用二氨基联苯胺作为过氧化物酶的底物，在酶催化下生成棕色沉淀，沉积于抗原所在位置。

5、复染与封片：苏木精复染细胞核，再经脱水透明后封片，便于显微镜下观察。

操作流程要点

1、切片脱蜡与水化：石蜡切片依次经二甲苯和梯度乙醇处理，使组织恢复至水相环境。

2、抗原修复：根据抗原特性选择高温高压、微波或酶消化等方法，暴露被甲醛交联遮蔽的抗原决定簇。

3、阻断内源性过氧化物酶：使用过氧化氢溶液孵育，减少非特异性背景着色。

4、血清封闭：采用与二抗种属相同的正常血清孵育，降低非特异性结合。

5、一抗孵育：按说明书推荐浓度和温度条件孵育，通常4摄氏度过夜或室温数十分钟。

6、二抗与SP复合物孵育：依次滴加生物素化二抗和链霉亲和素-过氧化物酶复合物，每步之间充分洗涤。

7、显色与终止：滴加二氨基联苯胺显色液，显微镜下控制显色时间，流水终止反应。

8、复染与观察：苏木精复染后封片，由病理医师判读阳性部位和强度。

方法特点与适用场景

1、灵敏度较高：链霉亲和素与生物素的结合常数极大，可放大弱抗原信号。

2、背景相对可控：链霉亲和素等电点接近中性，与组织内源性带电成分的非特异性结合少于部分传统方法。

3、适用石蜡切片：配合抗原修复，可用于回顾性研究及常规病理诊断。

4、可用于多种抗原：如细胞角蛋白、白细胞分化抗原、激素受体、病毒抗原等。

5、判读依赖标准化：不同实验室的修复条件、抗体浓度和显色时间差异可影响结果一致性。中华医学会病理学分会发布的免疫组织化学检测相关共识强调，应设立阳性和阴性对照，并规范前处理流程，以保证染色结果可重复。

结果判读与常见问题

1、阳性信号定位：二氨基联苯胺显色呈棕黄色，需与苏木精复染的蓝色细胞核区分。

2、阴性对照：以缓冲液替代一抗，若出现着色提示非特异性背景或内源性过氧化物酶残留。

3、阳性对照：选用已知表达目标抗原的组织，验证试剂和流程有效性。

4、背景过深：可能与抗体浓度过高、孵育时间过长、洗涤不充分或内源性过氧化物酶阻断不全有关。

5、假阴性：可能与抗原修复不足、抗体失效或组织固定过度有关。

免疫组化SP法通过链霉亲和素-过氧化物酶复合物实现信号放大，适合石蜡切片中多种抗原的定位检测，其判读需结合对照与规范流程。不同实验室应建立标准化操作并定期验证试剂性能。

常见问题

是免疫组织化学染色中的一种非生物素检测系统，利用链霉亲和素与生物素化二抗结合，再通过过氧化物酶催化显色底物定位抗原。

是，多数石蜡切片需进行抗原修复，以暴露被甲醛交联遮蔽的抗原决定簇，具体方法依抗原特性选择。

可检查抗体浓度、孵育时间、洗涤步骤及内源性过氧化物酶阻断是否充分，并设立阴性对照辅助判断。

是，该方法可用于多种抗原检测，包括部分病毒抗原，但需选用对应特异性一抗并设置合适对照。

参考资料

[1] 中华医学会病理学分会. 免疫组织化学检测相关共识. 中华病理学杂志.

[2] 王伯沄, 李玉松. 病理学技术. 人民卫生出版社.

[3] 刘彤华. 诊断病理学. 人民卫生出版社.