免疫组化怎么做？

免疫组化是由病理科技术人员在实验室中完成的标准化染色流程，受检者无需自行操作，只需按病理科要求提供合格的组织标本即可。该技术利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过显色反应在组织切片上定位特定蛋白，全程约需数小时至两天不等。

标本获取与固定

1、标本类型：免疫组化检测的标本通常为手术切除组织、穿刺活检组织或细胞块，标本离体后需在30分钟内放入足量中性缓冲福尔马林液中固定。

2、固定时长：小活检标本固定6至24小时，大标本需切开后固定12至48小时，固定不足或过度均可影响抗原可检测性。

3、脱水包埋：固定完成后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸透，最终制成蜡块，此步骤通常由全自动脱水机在14小时内完成。

切片与抗原修复

1、切片厚度：使用石蜡切片机制备3至4微米厚的连续切片，贴附于经防脱片处理的玻片上，60摄氏度烤片1至2小时。

2、脱蜡水化：依次经二甲苯及梯度乙醇至水，使组织切片恢复至水相环境。

3、抗原修复：依据目标抗原特性选择热诱导修复或酶消化修复，热修复常用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或乙二胺四乙酸缓冲液（pH 9.0），在95至100摄氏度条件下维持15至20分钟。据《中国病理技术操作规范》（2019年版）要求，每批次染色须设立阳性对照与阴性对照，以保证结果可靠性。

染色与显色

1、阻断内源性过氧化物酶：使用3%过氧化氢溶液室温孵育10分钟，减少非特异性背景着色。

2、一抗孵育：滴加适当稀释的一抗，室温孵育1小时或4摄氏度过夜，抗体稀释比例依说明书及预实验确定。

3、二抗孵育：滴加生物素化或聚合物标记的二抗，室温孵育20至30分钟。

4、显色：滴加二氨基联苯胺显色液，显微镜下控制显色时间，通常为3至10分钟，阳性信号呈棕黄色。

5、复染与封片：苏木素复染细胞核1至3分钟，经分化、返蓝、脱水、透明后中性树胶封片。

结果判读与质量控制

1、判读方法：由病理医师在光学显微镜下观察阳性着色部位与强度，结合阳性细胞百分比进行半定量评分。

2、质控指标：每批次检测须包含已知阳性组织对照，若对照不合格则整批结果作废。据国家病理质控中心2021年室间质评数据，参与单位免疫组化染色优良率为92.6%，不合格主要原因为抗原修复不足与抗体浓度偏差。

3、报告周期：常规免疫组化项目自收到蜡块起约2至3个工作日发出报告，急诊项目可缩短至24小时内。

免疫组化检测需由病理科专业人员按标准流程完成，标本固定质量与抗原修复条件对结果影响较大。送检科室应确保组织离体后及时固定，病理科需严格执行对照设置与批次质控。

常见问题

不需要。受检者只需配合临床完成组织活检或手术切除，标本由临床科室固定后送至病理科，后续流程均由技术人员完成。

是。该检测涉及固定、脱水、切片、抗原修复、抗体孵育及显色等多个步骤，每步均有时间要求，且需设置对照，故常规周期为2至3天。

否。阳性仅表示所检测的特定蛋白在组织中有表达，其临床意义需由病理医师结合形态学及其他指标综合判断，不能单独作为肿瘤诊断依据。

普通苏木素-伊红染色显示组织形态结构，免疫组化则通过抗原抗体反应定位特定蛋白，用于辅助分型、鉴别诊断及判断预后。

参考资料

[1] 中华医学会病理学分会. 中国病理技术操作规范. 2019.

[2] 国家病理质控中心. 免疫组化室间质评年度报告. 2021.

[3] 步宏, 李一雷. 病理学. 第9版. 北京: 人民卫生出版社, 2018.

[4] 中华病理学杂志. 免疫组织化学检测技术共识. 2019.