李子海副主任医师
南京市第二医院 皮肤科
革兰氏染色法是一种细菌分类和鉴定的常用方法，通过它可以将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类。革兰氏染色法步骤及注意事项如下：
1.制片：使用干净的玻片，取少量细菌培养物，用无菌生理盐水稀释，并在玻片上均匀涂抹形成薄膜，待自然风干后进行固定。
2.固定：将玻片在火焰上迅速通过数次，以使细菌粘附在玻片上，同时杀死细菌，避免在操作过程中脱落或传播。
3.初染：将结晶紫溶液滴加在固定好的细菌薄膜上，染色1分钟，使细菌细胞壁吸附结晶紫。
4.冲洗：用蒸馏水轻轻冲洗玻片表面，去除多余的染料，保持细菌细胞壁仍然着色。
5.媒染：滴加碘液（一般为卢戈氏碘液）覆盖细菌薄膜，静置1分钟，使结晶紫-碘复合物形成更加稳定的染色复合物。
6.脱色：用95%的乙醇或丙酮-乙醇混合液快速脱色，时间控制在15至30秒，直到不再有紫色流出为止。这一步决定了细菌是革兰氏阳性还是阴性。
7.冲洗：再次用蒸馏水轻轻冲洗玻片，去除脱色剂，准备进行反染。
8.反染：使用沙黄或番红染液染色30秒至1分钟，给未被初染染色的细菌着色。
9.最后冲洗：用蒸馏水最后冲洗玻片，去除多余的反染染料，晾干玻片后即可在显微镜下观察。
注意事项：
1.每一步骤的时间控制至关重要，尤其是脱色步骤，应严格按照规定时间操作，以免影响结果准确性。
2.操作过程应尽量避免气泡形成，以确保染色均匀。
3.用于染色和冲洗的试剂质量需保证纯净，以防杂质影响染色效果。
4.固定时火焰温度和通过次数需适当，以避免细菌细胞过热破裂。
5.对不同类型样本可能需要调整染色时间和浓度，以获得最佳效果。
革兰氏染色法是微生物实验室中基础且重要的技术之一，正确掌握各个步骤及注意事项能够有效区分革兰氏阳性和阴性细菌，为后续的细菌鉴定和治疗提供可靠依据。